4种食用菌硒积累能力比较与硒形态研究

4 种食用菌硒积累能力比较与硒形态研究
胡海涛1,2， 袁林喜2,3， 郑璞1*， 尹雪斌2*,3*， 朱元元3， 刘志奎3， 焦文宁3
（1.江南大学生物工程学院， 无锡214036； 2.中国科学技术大学苏州研究院， 苏州215123；3.苏州硒谷科技有限公司， 苏州215123)

硒是人和动物体内必需的微量元素[1~2]，是构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硒蛋白P 等多达23 种功能蛋白的活性中心， 具有很多对人体有益的功效， 而硒的严重缺乏会直接导致克山病和大骨节病[3]。土壤缺硒是全世界广泛存在的问题， 在我国存在一个从东北黑龙江省一直延伸到西南云南省的低硒带， 占据我国国土面积的72％。在这些低硒区， 农作物等食物的生长过程中无法从土壤中获取充足的硒， 从而形成食物链的普遍缺硒状态。营养强化被定义为通过最佳的传统育种措施和现代生物技术来发展高微量营养的主食作物[4]。食用菌是营养丰富的餐桌美食， 通过
对其进行硒营养强化， 可以使硒元素在食用菌内大量富集， 通过人体食用补充需要的微量元素硒。
尚德静等[5]、林琳等[6]、余杰等[7]、王新风等[8]、邓百万等[9]、于克学等[10]曾对不同种食用菌液体富硒能力进行过考察，而对其中硒的形态并未进行研究。铁梅等[11]对冬虫夏草和金针菇子实体中硒形态做过初步研究， 能准确测得蛋白硒、多糖硒和核酸硒3 种硒的含量。姚敏[12]和赵雷[13]分别对灵芝菌丝体和子实体硒形态进行过研究， 不仅测得蛋白硒是富硒灵芝中的主要形态， 还在蛋白质硒组分中， 对碱溶性、酸溶性和盐溶性蛋白质结合硒量进行区分。但对食用菌中蛋白硒、多糖硒等分子结构的研究目前仍鲜见报道。本文在前人研究的基础上对食用菌菌丝体中主要硒代氨基酸和含量进行的研究。选择硒代氨基酸含量丰富和富硒能力强的食用菌作为富硒的载体。

1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种
杏鲍菇、灵芝、云芝、鸡腿菇菌种购自中国微生物菌种保藏中心， 菌种编号分别是： 5.0653、5.0775、5.0161、5.0615。菌种保存在马铃薯综合培养基上， 培养温度25℃， 保存温度4℃。
1.1.2 培养基
斜面培养基： 马铃薯20%， 葡萄糖2%， 琼脂1.5%，MgSO4·7H2O 0.15%， KH2PO4 0.3%， VB1 0.001% （微量），pH=6.0；
一级液体培养基： 马铃薯20%， 葡萄糖2%， 蛋白胨1%， 酵母膏1%， MgSO4·7H2O 0.1%， KH2PO4 0.1%， VB10.001%， Na2SeO3 50 mg·L-1， pH=6.0。
1.2 试验方法
四种食用菌菌种， 在固体斜面上转接3 次培养后， 分别取5 块0.5 m2 大小的菌种， 接到对应的一级液体培养基中， 进行液体富硒培养。培养条件： 30℃， 150r·min-1、10d、500 mL 三角瓶装液量100 mL， Na2SeO3添加量50 mg·L-1。选择该浓度的硒添加量是因为此浓度下的硒不显著抑制菌丝体的生长， 而且菌丝体转化的氨基酸态有机硒的含量足够进行形态分析。
1.3 分析方法
1.3.1 菌丝干重测定
收获的发酵液经4 000r·min-1 离心5min， 弃上层清液， 沉淀物用蒸馏水清洗， 再离心， 重复清洗-离心操作直至上清液不再带有发酵液颜色为止， 收集菌体， 真空冷冻干燥， 称重， 计算菌丝生物量如下： 生物量/g·L-1= (菌丝干重/g) ÷ (发酵液体积/L)。
1.3.2 还原糖含量测定
采用DNS 比色法[14]： 取2mL 样品加入1.5mL DNS 溶液， 沸水浴反应5 min， 迅速冷却， 定容至25mL， 用分光光度计（T6， 普析通用） 测OD520 值。
1.3.3 菌丝体中总硒及硒代氨基酸的检测
1.3.3.1 菌丝体总硒含量测定
称取一定量的样品于锥形瓶中， 用HNO4： HClO4 (V/V=4:1) 冷消解过夜， 第二天于电热板上加热消解至溶液澄清时， 赶酸， 待溶液冷却后， 加入盐酸还原3 h， 然后定容至比色管中， 用原子荧光光谱仪（HG-AFS， 北京）进行检测[15~17]。
1.3.3.2 菌丝体硒代氨基酸形态检测
样品研磨处理后， 称取定量样品溶于水中， 加足量蛋白酶水解后利用液相色谱-原子荧光光谱仪联用（LC-UVAFS，北京） 进行硒代氨基酸形态的测定， 可检测出硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet) 等3 种硒代氨基酸和4 价硒(Se (IV)) 含量[18~21]。
1.4 数据分析
1.4.1 硒利用率的计算
硒源利用率=菌丝体硒含量（μg·g-1） ×菌丝体干重（g·L-1） /培养基内硒含量（μg·L-1） ×100%
1.4.2 硒提取率计算
硒提取率/%=提取液中总硒（μg） /样品中总硒（μg）×100%
2 结果与讨论
2.1 杏鲍菇、灵芝、云芝和鸡腿菇的富硒能力比较
对杏鲍菇、灵芝、云芝和鸡腿菇4 种食用菌在添加50 mg·L-1 Na2SeO3的一级液体培养基中培养10 d， 以生物量、总硒含量和硒利用率为指标比较它们的富硒能力(表1) 。从表1 中可以看出， 杏鲍菇和灵芝能在50 mg·L-1Na2SeO3的培养基中正常生长， 生物量分别达到9.8 g·L-1和6.7 g·L-1， 而云芝和鸡腿菇则生长较差， 尤其是鸡腿菇， 生物量仅为0.6 g·L-1。在同样培养基中， 对4 种食用菌做不添加硒的对照组实验发现， 云芝和鸡腿菇的生物量仍很低， 表明云芝和鸡腿菇可能具有低生物量的特性或此培养基不适合其生长有关。从总硒含量上来看， 杏鲍菇硒含量也是比较高的， 达到5 000 μg·L-1 以上， 灵芝次之，达到4 426 μg·L-1， 云芝和鸡腿菇的总硒含量分别为3 006μg·L-1 和2 521 μg·L-1。从硒利用率上来看， 杏鲍菇的硒利用率也是最高的， 约为22%， 灵芝次之， 达到19%， 而云芝和鸡腿菇则只有13%和11%， 明显低于杏鲍菇和灵芝。

余杰等[7]曾对鸡腿菇二级液体深层培养进行富硒动态研究， 在2 mg·L-1 的最优硒添加浓度下， 生物量为4.1 g·L-1， 总硒含量达到1 014 μg·L-1， 硒利用率为50.6%。当硒含量大于2 mg·L-1 时， 生物量急剧下降， 并随着硒含量的增加， 有继续降低的趋势。虽然其并未在50 mg·L-1Na2SeO3浓度下对鸡腿菇液体富硒能力进行研究， 但其研究结果已表明鸡腿菇具有低生物量的特性， 同时， 不适合高硒添加浓度下液体的培养， 与本实验结果一致。云芝和灵芝是一种极耐硒的药用真菌， 富硒特性优良， 是一种理想的有机硒载体。尚德静等[5]指出灵芝对硒的耐受浓度高达500 μg·g-1。邓百万等[9]在驯化云芝的二级液体培养中添加50 mg·L-1 Na2SeO3， 生物量可达7.8 g·L-1， 总硒含量高达10 140 μg·L-1， 硒利用率为23.4%。王新风等[8]对杏鲍菇二级液体富硒培养12d， 当添加Na2SeO3浓度40 mg·L-1时， 生物量为6.9 g·L-1， 总硒含量最高达到8 693 μg·L-1，硒利用率为21.7%。其研究结果皆表明杏鲍菇、灵芝和云芝有很好的富硒性能和高生物量的特性， 与本实验研究结果基本一致。相对于尚德静等[5]报道的灵芝是金针菇、香菇、猴头菇和灵芝4 种食用菌中发现的富硒能力最强的菌株而言， 本研究发现杏鲍菇的硒积累能力不亚于灵芝， 有可能成为同灵芝相媲美的优良富硒载体。

2.2 杏鲍菇、灵芝、云芝和鸡腿菇的硒形态分析
表2 显示杏鲍菇、灵芝、云芝和鸡腿菇菌丝体中的硒形态组成特征， 结果显示其中的硒主要以硒代胱氨酸(SeCys2) 、硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys) 、硒代蛋氨酸(SeMet) 和4 价硒(Se (IV)) 形式存在， 其相对组成比例如图1 所示。杏鲍菇中， SeCys2、SeMeCys、SeMet、Se (IV)分别占到提取液总硒的1.9%、8.5%、18.5%、0.3%； 灵芝中， SeCys2、SeMeCys、SeMet 分别占到提取液总硒的2.7%、8.4%、75.6%， Se (IV) 无检出； 云芝中， SeCys2、SeMeCys、SeMet 分别占到提取液总硒的8.3%、2.7%、80.0%， Se (IV) 无检出； 鸡腿菇中， SeCys2、SeMeCys、SeMet、Se (IV) 分别占到提取液总硒的12. 1%、10.8%、54.0%、0.5%。杏鲍菇、灵芝、云芝和鸡腿菇的菌丝体干样的硒含量分别是519.0 mg·kg-1、662.5 mg·kg-1、897.4mg·kg-1、4 132 mg·kg-1 干重， 菌丝体硒蛋白经过降解后提取液中硒含量分别是135.0 mg·kg-1、111.9 mg·kg-1、199.1mg·kg-1、151.7 mg·kg-1 干重， 硒提取率分别是26.0% 、16.9%、22.2%、3.7%。

目前国内外对食用菌硒形态的研究尚不够深入。从文献报道看， 鲜有食用菌硒代氨基酸形态方向的研究。李红丽[22]采用LC-UV-AFS， 检测得硒在秀珍菇子实体中的主要状态是硒代蛋氨酸(SeMet) （高于70%）， 其余以硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys) 及未知态的有机硒等有机态存在， 关于食用菌菌丝体硒代氨基酸形态的研究还未见报道。更多硒代氨基酸形态的研究集中在植物学领域。Mazej et al.[23] 利用HPLC-UV-HG-AFS 测定了以硒酸钠为硒源， 通过气栽法培养41 d 后的菊苣叶片中的硒形态， 其中总硒含量为480， 其中Se6+占总硒的
64%， SeMet 的含量占总硒的4.2%~ 8.4%， SeMeCys 的含量占总硒的百分比不到0.7%， 此外， 还有一些未知形态的有机硒化合物出现。Sasi et al.[24]用毛细管电泳的方法分离巴西干果提取液中的各种含硒物质， ICP-MS 检测亚硒酸、硒酸、硒胱氨酸和硒蛋氨酸， 计算各种硒的相对含量， 认为硒代蛋氨酸是巴西干果中硒的主要形式。张涛等[25] 用HPLC-ICP-MS 法对富硒大米的酶解液中的硒代氨基酸含量进行分析， 发现大米中的硒主要以硒代半胱氨酸的形式存在。Smrkol et al.[26]用HPLC-UV-HG-AFS 对喷洒了硒酸钠溶液的苦荞麦进行硒的形态分析， 发现荞麦种子提取物中（93±5) ％的硒为硒代蛋氨酸。Zovne et al.[27] 用1mg·L-1 的Na2SeO3溶液培养富硒花椰菜， 发现硒蛋氨酸是根中主要氨基酸， 而硒甲基硒半胱氨酸是花椰菜果实的主要氨基酸。
本研究在前人研究的基础上， 对液体培养的食用菌菌丝体中蛋白硒形态进行测定， 测得食用菌菌丝体内存在硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸等3 种硒代氨基酸形态， 且硒代蛋氨酸是其主要氨基酸形态。这与李红丽[22] 报道的秀珍菇子实体中的结果相同。但是研究中发现4 种食用菌菌丝体中SeCys2、SeMeCys 和SeMet 所表征的蛋白硒仅占菌丝体总硒的20%左右或更低， 一方面原因可能是食用菌菌丝体中硒代氨基酸的提取方法尚不成熟， 硒代氨基酸没有提取完全； 另一方面原因可能是食用菌经过硒的液体深层营养强化获得的蛋白硒可能只占有机硒的少部分， 无机硒并没有大量转化成蛋白硒， 可能更多的以多糖硒、核酸硒等形式存在， 关于食用菌硒代氨基酸的提取方法和检测技术还有待更深入的研究。

3 结论
3.1 本文在50 mg·L-1 Na2SeO3浓度下对4 种食用菌一级液体培养富硒能力进行比较， 富硒能力由强到弱顺序为：杏鲍菇>灵芝>云芝>鸡腿菇;
3.2 在四种食用菌中， 硒与氨基酸的主要结合形式都是硒代蛋氨酸， 硒代胱氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸占比不高。在云芝硒代氨基酸提取液中， 硒代蛋氨酸含量最高达到80.0%以上， 灵芝次之， 大约75.6%。在灵芝硒代氨基酸提取液中， 3 种硒代氨基酸含量和最高， 达到86.6%。杏鲍菇中3 种硒代氨基酸含量和最低， 不到30%；
3.3 从富硒能力和硒代氨基酸含量两个因素综合考虑，灵芝是食用菌中最具潜力的富硒材料。开发灵芝富硒材料或富集硒蛋白、硒多糖等有机硒含量高的食用菌材料， 作为硒补充剂或食品添加剂， 将是未来补硒的良好途径。