2种灵芝液体培养的比较研究

赤芝（Ganoderma lucidum) 和松杉灵芝（Ganodermatsugae ） 均属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝菌属。有关学者发现赤灵芝多糖可减轻动脉粥样硬化风险，降低血脂。郑克岩等人通过小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠睾丸染色体畸变和Ames 试验观察了松杉灵芝多糖的抗突变作用[1]。大量实验证明， 灵芝多糖具有提高人体免疫能力、抗癌、抗病毒、护肝、延缓衰老、防止慢性支气管炎和镇静止痛等功效。
由于灵芝多糖的药用价值高， 近年来， 灵芝多糖畅销于东南亚各国、台湾和香港等地。市场需求量日趋增加，供求关系紧张。子实体和菌丝体在药用价值方面相同， 由于子实体生产周期长， 受气候影响大， 影响产量及质量，通过液体培养菌丝体取代人工栽培子实体， 大大缩短生产周期， 提高灵芝多糖的生产能力。对解决资源匮乏、满足市场需要、提高经济效益， 均具有十分重要的意义。在灵芝多糖含量研究方法方面近几年一直都有报道。于浩瀚等[2]对灵芝深层发酵菌丝体多糖含量的测定， 结果表明以超声波破壁处理后， 再以热水浸提法提取， 多糖得率可以明显提高。多糖含量的测定方法， 前人学者研究了苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3， 5-二硝基水杨酸法、Fehling 滴定法、碘量法、高效液相色谱法等多种测定方法。赵阳楠[3]等研究了苯酚硫酸法和间接碘量法测定灵芝多糖含量比较， 结果显示测定总糖的结果基本一致， 均不需要精密仪器， 操作简便， 稳定可靠。通过前人的研究总结， 多糖含量测定的方法基本成熟， 只是在具体实验操作中可根据不同的实验目的和实验条件选择合适的方法。
近年来， 国内外许多学者都集中于研究赤芝和松杉灵芝液体培养营养需求和多糖提取测定的研究。例如， 泰山赤灵芝液体培养条件优化及多糖含量测定[4]，松杉灵芝发酵菌丝体中水溶多糖的分离纯化与结构的比较研究[5]。但众多的研究都是单一地对赤芝或者是松杉灵芝来研究测定， 还没有对它们进行比较探究。本试验通过在相同的液体培养条件下， 对赤芝和松杉灵芝的多糖含量得率进行比较， 旨为发酵培养工厂化研究提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
赤芝、松杉灵芝菌种： 韶关学院英东生命科学学院微生物学实验室提供。
1.1.2 试验试剂
去皮马铃薯、KH2PO4、MgS04·7H2O、琼脂、葡萄糖、0.1%蒽酮-硫酸、95%乙醇、蒸馏水。
蒽酮试剂： 称取0.1g 蒽酮， 溶于80%浓硫酸（ 将98%浓硫酸稀释， 把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 100mL， 冷却至室温， 储存于棕色瓶内， 冰箱保存， 现配现用。
1.1.3 仪器设备
三角瓶、纱布、容量瓶、圆底烧瓶、研磨钵、10 mL离心管、超净工作台、可调速旋转式摇床、电子天平、高速离心机、可见光分光光度计， 水浴锅等。
1.1.4 培养基
种子培养基： PDA 培养基。
取去皮马铃薯200 g， 切成小块， 加水煮沸30 min，滤去马铃薯块， 将滤液定容至1 000 mL， 加葡萄糖20 g，琼脂15 g， 0.1 MPa 灭菌30 min， 摆斜面。（不加琼脂就是种子液体培养基）。
液体培养基： 在PDA 培养基中加KH2PO4 3 g、MgS04·7H2O 1.5 g （不加琼脂）
1.2 方法
1.2.1 菌种活化[6]
将保存的赤芝和松杉灵芝菌种接种到斜面培养基上，28℃培养7 d。
1.2.2 菌丝体液体培养与收集
取约0.5 cm2 大小的活化菌种转接于装有100 mL 种子液体培养基的250 mL 三角瓶中， 每瓶接种3 块~4 块，28℃， 150 r·min-1， 振荡培养6 d。将大约10 mL 种子培养液分别接入100 mL 培养基中， 28℃， 150 r·min-1 振荡培养4 d。用3 层纱布将发酵液过滤， 蒸馏水洗涤3 次， 将菌丝体收集60℃烘干至恒重， 研磨成菌粉备用。2 种供试菌种均设2 次重复， 每次重复中赤芝和松杉灵芝各培养5瓶[2,6]。
1.2.3 菌丝体生物量的测定

1.2.4 赤芝和松杉灵芝多糖的提取
分别称取赤芝和松杉灵芝菌粉约0.3 g， 至于圆底烧瓶中加水50 mL 沸水浴中浸提2 h， 放冷至室温， 转移至100 mL 容量瓶中， 用少量水分次洗涤容器， 洗液并入同一容量瓶， 加水至刻度， 摇匀， 过滤， 精密量取滤液2mL 分别装于3 支10 mL 离心管中， 按1∶4 比例每支离心管加95%乙醇8 mL， 摇匀， 至于冰箱中冷藏过夜。次日取出， 4 000 r·min-1 离心20 min， 弃上清液， 沉淀加75%乙醇， 洗涤2 次， 沉淀加热水溶解， 转移至25 mL 容量瓶中， 放冷， 加水至刻度， 摇匀， 作为待测溶液[8]。
1.2.5 赤芝和松杉灵芝多糖含量的测定： 蒽酮-硫酸法[3,9]
（1） 葡萄糖标准曲线的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg， 置于100 mL 容量瓶中， 加水适量使溶解， 稀释至刻度， 摇匀。精密吸取10 mL 置于100 mL 容量瓶中， 加水定容至刻度。即得到浓度为100 μg·mL-1 葡萄糖对照品溶液。取6 支10 mL 具塞试管， 从0~5 编号， 按表1 分别加入各试剂。将各管快速摇动混匀后， 放在沸水浴中15 min， 取出冷却， 在625 nm 波长下， 用空白调零测定吸光度， 以吸光度（A） 为纵坐标， 葡萄糖浓度（C） （μg·mL-1） 为横坐标绘制标准曲线， 得一不过原点的直线。葡萄糖的浓度在20 μg·mL-1~100 μg·mL-1 范围内与吸光度呈良好的线性关系， 见图1。回归方程为A=0.0062C+0.0264， r=0.9982。
表1 蒽酮-硫酸法测多糖制作标准曲线的试剂量及测定结果


（2） 赤芝和松杉灵芝待测溶液多糖含量的测定
分别精密吸取1.2.4 所得的待测溶液1 mL， 置于10mL 具塞试管中， 加入5 mL 蒽酮试剂， 照标准曲线制备项下的方法， 依法测定吸光度（A）。由回归方程计算待测溶液中葡萄糖浓度（C）， 按照下式计算赤芝和松杉灵芝多糖含量[10]。
W=C·V·f/m×100%
式中： W 为多糖含量（%）； C 为待测溶液中葡萄糖浓度（μg·mL-1）； f 为待测溶液稀释倍数； V 为样品定容体积；m 为样品的质量（μg）。

2 结果与分析
2.1 赤芝和松杉灵芝液体培养菌丝体生长比较
在重复Ⅰ和重复Ⅱ的培养中， 从肉眼观察， 赤芝菌丝体生长速度快， 松杉灵芝菌丝体生长速度较慢， 而且赤芝菌丝球体积比松杉灵芝菌丝球要大。以获取菌丝体为目标则可首选赤芝， 其生长速度快但衰老和自溶速度也快， 因此要把握其发酵时间。对液体培养的菌丝体干重进行测定， 测定结果如表2。

从表2 得知， 赤芝菌丝体干重平均值为0.640 g·100-1·mL-1， 松杉灵芝菌丝体干重平均值为0.426 g·100-1·mL-1。测定结果表明， 液体培养的菌丝体干重赤芝也比松杉灵芝高。
2.2 赤芝和松杉灵芝多糖含量比较
不同菌株生物活性多糖的含量由于菌种特性、培养条件的不同存在差异[2]。在相同的培养基、相同的培养温度、转速、时间， 对赤芝和松杉灵芝进行液体培养， 并用相同的提取方法提取多糖， 对它们的菌丝体多糖含量进行测定。测得数据如表3、表4。


从表3、表4 得知， 两种菌株在两批的液体培养中，赤芝多糖含量平均值为7.22%， 松杉灵芝多糖含量平均值为3.78%。测定结果表明， 赤芝菌丝体多糖含量比松杉灵芝高。
综上所述， 本试验通过在相同的培养条件对赤芝和松杉灵芝， 采用蒽酮-硫酸法测定它们的多糖含量， 得出的结果是液体培养的菌丝体生长速度赤芝比松杉灵芝快， 多糖含量也比松杉灵芝高， 因此赤芝更适合用于液体培养生产灵芝多糖。
3 讨论
3.1 培养条件的选择
在赤芝和松杉灵芝液体培养中选择最普通的加富PDA培养基， 减少了两种灵芝生长营养成分的差异。由于赤芝生长速度快自溶速度也快， 所以要控制好培养时间， 要在赤芝未发生自溶之前就要将两种灵芝的菌丝体收集。
3.2 提取方法
不同的提取方法对灵芝菌丝体中多糖的提取率不同[8]。本法采用沸水浴提取， 提取时间确定为2 h， 然后用乙醇醇析过夜， 对赤芝和松杉灵芝多糖提取率均属正常， 该法操作简易， 切实可行。今后可研究赤芝和松杉灵芝最佳的提取时间： 延长提取时间或者进行多次提取； 乙醇醇析的时间可以根据试验的需要， 延长或者缩短来达到最好的提取效果。
3.3 测定的方法
多糖含量测定的方法有很多， 但是常用的多数是苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、间接碘量法等。通过前人学者的研究， 证明测定多糖的方法对多糖含量的影响不大， 结果基本一致。但是如果是操作上的误差， 就会对试验结果造成很大影响。由于苯酚容易氧化， 见光或遇氧即氧化成淡红色， 对显色有干扰。间接碘量法中要加硫代硫酸钠，由于它具不稳定性， 而且碱容易影响碘挥发， 会使测定产生误差。蒽酮-硫酸法中蒽酮都会受光和氧的影响对显色有干扰， 蒽酮是溶于硫酸中。苯酚-硫酸法中， 是先加苯酚再加硫酸， 多次滴加试剂， 容易造成剂量的误差[3]。蒽酮硫酸法使用起来比较方便， 涉及的药品比较少， 避免了药品不稳定性产生的误差， 操作容易。
3.4 菌丝体产量的比较
从2.1 测定的结果来看， 赤灵菌丝体产量比松杉灵芝高， 这可能是菌株自身的生物特征影响着其产量， 就从肉眼观察就可以粗略地判断赤芝和松杉灵芝菌丝体产量高低， 赤芝菌球体体积明显比松杉灵芝大， 而且生长密集，所以以获取菌丝体为目标， 优先选择赤芝。
3.5 多糖含量和测定方法比较
从2.2 测定的结果来看， 重复Ⅰ中赤芝和松杉灵芝多糖含量都比重复Ⅱ高， 产生的原因可能是菌丝体开始发生自溶现象使多糖含量降低， 又或者是测定时操作上产生的误差。从两次的培养中赤芝多糖含量明显比松杉灵芝多糖含量要高， 因此以生产灵芝多糖为前提， 赤芝是优先选择的菌株。试验结果看得出赤芝多糖含量比松杉灵芝多糖含量高， 产生这结果的原因有： 灵芝菌株特有的生物特性决定了它本身的有效成分的高低， 可能是松杉灵芝多糖含量比较低， 其它有效成分比较高， 分配比例不同； 培养条件也影响着结果， 有可能是培养基还没有达到两种灵芝的最佳营养需求， 如培养温度、时间还没有调节好， 也有可能影响结果。
3.6 存在问题及解决方法
液体培养时， 菌丝体要与空气充分接触， 进行氧气交换， 用瓶塞由于封闭太密， 空气得不到充分流通， 菌丝体生长受到抑制， 影响生长速度。为了达到充分氧气交换，改用8 层纱布和2 层报纸盖住三角瓶口。在试验的液体培养过程中， 发现赤芝菌丝体生长速度比松杉灵芝快， 而且菌丝球体大， 很快就长满三角瓶。此试验要求在相同的培养条件下， 即培养时间也相同， 所以选择收集菌丝体的时间是一个关键， 在确保赤芝菌丝体还未发生自溶的前提下， 同一时间收集成熟的松杉灵芝菌丝体。在烘干过程中， 如果时间过长， 菌丝体就会发生自溶影响多糖的含量， 因此为了尽快将其烘干， 将菌丝体分装在多个容器里烘干至恒重。
本试验是采用热水浸提法提取多糖、蒽酮-硫酸法测定多糖， 由于提取的方法会影响多糖含量， 所以可以进一步尝试用其它方法来提取后， 再蒽酮-硫酸法测定赤芝和松杉灵芝多糖含量进行比较研究。