北虫草菌种人工分离的研究

北虫草菌种人工分离的研究
杨玉红1，2，刘芳2，康宗利2，段玉玺1*
（1.沈阳农业大学植物保护博士后流动站，辽宁沈阳110866；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866)

1 材料与方法
1.1 材料试剂与仪器
1.1.1 供试菌株
沈阳棋盘山野生的蛹虫草菌株。
1.1.2 培养基
马铃薯100 g、葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、KH2PO4 0.5g、MgSO4 0.25 g、琼脂10 g，加蒸馏水至500 mL，煮沸使琼脂完全融化，高压蒸汽灭菌121℃， 30 min。
1.1.3 试剂
75％酒精，无菌水。
1.1.4 主要仪器
手提式压力蒸汽灭菌锅、分析天平、超净工作台、HPX-9082MBE 数显电热培养箱，其他常用玻璃仪器等。
1.2 试验方法
1.2.1 不同的组织部位分离方法比较
（1）子实体分离法
在超净工作台上将虫草子实体用75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3 次，再用小刀分别切取子实体顶端、中部、根部，然后接种到斜面培养基上， 18℃恒温培养15 d。观察不同组织部位对北虫草萌发天数、长势、满管时间的影响[1]。
（2）孢子分离法
上述方法洗涤得到的子实体，用小刀切取尖端，悬挂在三角瓶棉塞下端的不锈钢弯钩上，通过悬挂虫草子实体，使顶端朝下，散落下来的孢子落在培养基上，从而继续生长，并产生白色菌丝。在培养的前期，要保证室温不能过高，因此本试验在培养时，将三角瓶置于充满凉水的盆中，并需要每天换水，维持较低的水温。在18℃恒温培养5 d 后，无菌条件下取出子实体尖端，将三角瓶放回，继续培养10 d[2]。
1.2.2 不同的消毒方式比较
以子实体顶端为例，处理方法见表1。

接种到斜面培养基上， 18℃恒温培养15 d。观察不同消毒方式对北虫草萌发天数、长势、满管时间的影响。
1.2.3 继代培养试验
挑选长势好的分离菌种，接种到玻璃瓶中，将玻璃瓶放入培养室培养。

2 结果与分析
2.1 组织分离法分离北虫草菌种的研究
2.1.1 不同组织部位对北虫草萌发天数的影响
通过对同一株北虫草分别切取顶端、中端和根部，采用相同的消毒方式进行除菌。可以看出，在培养的最初阶段，在培养顶端和中端部位的试管中，北虫草两端均有白色菌丝生长，而在培养根部部位的试管中，没有白色菌丝生长（图1）。

2.1.2 不同组织部位对北虫草长势的影响
匍匐型菌丝的有无可作为判定菌种优劣的依据，其量越多，菌种质量越优[3]。随着培养时间的延续，在培养3 种不同北虫草部位的试管中，均产生了白色菌丝，长势上并没有出现差异。
2.1.3 不同组织部位对满管时间的影响
经过若干天的培养， 3 种不同部位的北虫草菌丝体并未出现明显的满管现象。
2.1.4 孢子分离法分离北虫草菌种的研究
孢子分离法培养前期如图2-A，培养2 d 后，培养基上已有少量的菌丝生成（图2-B），培养5 d 后，培养基上已经形成了大量的菌丝（图2-C）。此时，在无菌条件下取出子实体，继续培养10 d。从萌发时间和长势上看，孢子分离法分离得到的菌株品质更优。

2.2 不同消毒方式的影响
2.2.1 不同消毒方式对北虫草萌发天数的影响
北虫草子实体本身就具有一定的抑菌能力[4]，即便未用酒精进行消毒处理，在菌丝体的两端也有菌丝生成，并且未经过酒精处理的菌丝体（1 号、2 号）萌发较早、较旺盛。
2.2.2 不同消毒方式对北虫草长势的影响
未经过酒精处理的2 组长势较好，并且有明显的匍匐状菌丝出现。而经过酒精处理过的3 组长势一般，其中后2 组还有未出现菌丝的情况发生，出现这种状况的原因可能是由于在使用酒精消毒的过程中，浸泡时间过长，使菌丝体活性丧失。
2.2.3 不同消毒方式对北虫草满管时间的影响
未经过酒精消毒的2 组（1 号、2 号）北虫草菌丝体，在培养8 d 后，菌丝体长满了整个试管，而其余几组则没有满管的现象出现。
2.3 继代培养验证
孢子分离法分离得到的菌株，经继代培养得到的虫草子实体（图3），色泽和产量都很好，这验证了孢子分离法分离得到的菌株品质更优这一结论。

3 结论与讨论
3.1 结论
通过实验可得出，第一，子实体靠近顶端分离的菌种易于萌发，孢子分离得到的菌种品质更优；第二，北虫草子实体本身就具有抑菌作用，因此，在选取表面消毒方式时，一定要适宜，不可时间过长，以免对子实体造成伤害，不产生菌丝。
3.2 讨论
目前国内有关北虫草的研究很多，但多为分类、品种资源分布方面的工作，栽培生产方面的研究报道尚少，对此菌的生物学特性、遗传特性等尚未尽悉搞清。在组织分离获取菌种的实验中发现，在子实体有龟背状花纹的顶端切取组织，获得的菌种种性优，产量高。北虫草菌种转管次数增多，子实体产量下降，生产上菌种转管次数不宜超过3 次。