冬虫夏草发酵技术的研究进展

冬虫夏草发酵技术的研究进展*
劳景辉2，闫文娟1，方佳茂3，陈伟滨3
(1.广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广东广州510070；2.广东迪美生物技术有限公司，广东广州510070；3.广东环西生物科技股份有限公司，广东揭阳515343)

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis (Berk.) G. H. Sung,J. M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora，是线虫草科（Ophiocordycipitaceae）、线虫草属（Ophiocordyceps） 的虫生真菌[1]，寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体上，由虫形菌核（僵虫） 和子座（草部） 组成。由于冬虫夏草具有多种的药理活性，如抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化和提高免疫力等[2]，一直被视为珍贵的中药材而得到广泛的应用。但鉴于天然冬虫夏草对生长环境要求高，生长率低，加之人们对其需求的日益增加，使得野生的冬虫夏草资源紧缺，其价格甚至比黄金还高。因此，以发酵等方法探索对冬虫夏草进一步开发利用的新途径成为了研究的热点。本文从冬虫夏草发酵无性型菌株的鉴定及筛选、液体发酵工艺的优化、固体发酵技术的开发和发酵产物的评价及应用等方面对冬虫夏草发酵进行了综述。

1 冬虫夏草发酵菌株的研究概况
发酵研究的关键之一是要采用真正的冬虫夏草菌株。由于部分早期研究没有考虑到冬虫夏草不适应高温、生长缓慢等特点，加上其它技术上的原因，致使部分用于发酵研究的“冬虫夏草”菌株其实只是长于冬虫夏草上的其它菌。但随着对冬虫夏草的认识不断加深及相关研究技术的发展，真正的冬虫夏草开始被广泛研究。1977 年，沈南英开始对冬虫夏草生态进行研究，2 年后成功分离到冬虫夏草菌种（该菌种的无性型后被证明为中国被毛孢）[2]，并于1983 年首次发表了有关该真菌菌种分离研究的论文[3]。1989 年刘锡王进等分离到与沈南英相同的冬虫夏草菌种无性型，定名为中国被毛孢（Hirsutella sinensis X.J. Liu, Y.L.Guo, Y.X. Yu & W. Zeng） 并正式发表[4]。1999 年赵锦等从分子生物学角度证明冬虫夏草无性阶段是中国被毛孢[5]，并于2000 年把该鉴定方法申请中国专利，即鉴别冬虫夏草的特征性核苷酸序列和方法（CN00114160.0）。2004 年蒋毅等认为中国被毛孢与天然冬虫夏草菌种一致[6]。2005 年中国菌物学会再次确认冬虫夏草菌的无性型是中国被毛孢。至于冬虫夏草的有性型名称，过去曾长时间采用Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.的拉丁学名，到2007 年则变为Ophiocordyceps sinensis (Berk.) G. H. Sung, J. M. Sung,Hywel-Jones & Spatafora [1， 7]，中文可译为中国线虫草（即冬虫夏草）。本文采用了这一新的拉丁学名。
近年来报道从冬虫夏草上分离出来的无性型有很多，但只有中国被毛孢（Hirsutella sinensis） 经接种蝙蝠蛾幼虫，并完成了从染菌直到长出子实体的全过程，证明是冬虫夏草的无性型菌株[8]，而冬虫夏草头孢（Cephalosporiumdongchongxiacae N. Y. Shen, S. M. Zhang, L. Zeng, X. C.Zhang & S. L. Wei）、虫草头孢（Cephalosporium sinensis C.T. Chen）、蝙蝠蛾被毛孢（Hirsutella hepiali C. T. Chen &N. Y. Shen） 和中华束丝孢（Synnematium sinense X. C. Yin& N. Y. Shen） 等也已被证明是中国被毛孢（H. sinensis）的同物异名[9， 10]，而其它更多的发酵菌株则尚未确定是中国被毛孢（H. sinensis），因此相关的研究还需继续进行，而本文所综述的发酵研究，均基于可靠的菌种来源或其菌株符合冬虫夏草的生长规律。

2 冬虫夏草液体发酵的研究概况
菌丝体干重是冬虫夏草液体发酵条件及培养基筛选的主要指标之一。张忠广等发现在pH 5.5、装量40%、温度18℃～20℃、转速100 r·min-1～120 r·min-1、培养时间96 h的适宜条件下，以S31 培养基和a 培养基，对冬虫夏草菌进行液体发酵，得到的菌丝干重达0.028 g·mL-1 左右[11]。多糖作为冬虫夏草的重要有效成分之一，其产量也常被作为实验的评价指标。全卫丰等以产胞外多糖为参考指标，对冬虫夏草液体发酵培养基及发酵条件进行研究，发现培养基配比为蔗糖3%、玉米粉5%、豆饼粉4%、七水硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.1%、维生素B1 为0.01%，于22℃、pH 6.5、转速120 r·min-1，摇瓶培养7 d，所得胞外粗多糖产量为5.86 g·L-1[12]；张国英对冬虫夏草无性型菌株中国被毛孢进行了原生质体的紫外诱变育种，以菌丝体湿重和多糖含量为指标，筛选出诱变菌株M1069#，通过鉴定后对其进行培养基单因素实验和优化实验，得出最优化发酵培养基，实验后得到的菌丝体含量达6.31 g·瓶-1，多糖含量为12.1%[13]。
近年来，Dong 等对冬虫夏草深层发酵进行单因素和正交实验，发现培养基中含有蔗糖、蛋白胨、维生素B、钙、锌和碳氮比为12∶1 时是最有利于菌丝体生长的，而蔗糖、蛋白胨和酵母提取物的最佳浓度分别是50 g·L-1、10 g·L-1 和3 g·L-1，经过40 d 的发酵，所得的菌丝体生物量超过22 g·L-1[14]；随后，Dong 等又进一步发现6 株冬虫夏草菌株的最适生长温度范围是15℃～18℃，超过21℃时则生长缓慢，达25℃及以上温度时便会停止生长；而冬虫夏草的生长周期即使在最佳条件下，依然相对较长，其液体发酵也经历延滞期、对数生长期、稳定期和死亡期，当中的对数生长期更是长达10 d，如果以菌丝体作为目标产物，则整个发酵周期需25 d～30 d[15]。

3 冬虫夏草固体发酵的研究概况
3.1 固体发酵概述
相对于液体发酵技术，固体发酵的设备较为简单，而且废液排放少，有利于减轻环境污染及生产成本控制，并且其后处理相对简单，只需将发酵物干燥粉碎即可，可避免液体发酵技术工艺复杂、容易污染和设备投资大等缺点。另外，固体发酵对于某些研究材料来说，可以比液体发酵的产量有所提高，而且该发酵方式特别适合于丝状真菌[16]，因此，真菌的固体发酵技术已逐渐得到人们的重视，但有关冬虫夏草固体发酵的研究却少有报道。
3.2 冬虫夏草固体发酵及其应用研究
葛飞等以麦角甾醇含量为指标，对冬虫夏草无性型，即中国被毛孢的固体发酵进行研究，发现固体发酵最佳培养基为大米5 g、玉米粉2 g、蚕蛹粉1 g、麦麸2 g，适宜的培养条件为培养温度20℃、料水比1∶1.5、料层厚度2cm，且无光照时对菌丝生长较为有利，所得菌丝体的麦角甾醇含量较未优化的提高了38.6%[17]。Zhang 等发现陈米经过冬虫夏草菌的发酵后，其营养物质如蛋白质、碳水化合物、脂质、膳食纤维、维生素E、氨基酸和麦角甾醇等都高于发酵前的陈米，而且提高了其超氧化物歧化酶的活性，为陈米的有效利用提供了一种新方法[18]；王祥诚等利用冬虫夏草菌来发酵蕨渣，生产菌质多糖，发现最佳工艺条件为蕨渣比例85%、基质含水量60%、培养温度22℃，而且基质含水量偏低有利于菌丝生长，如果偏高则菌质多糖得率偏高[19]。闫文娟等对冬虫夏草固体发酵物的抗疲劳作用进行了研究，发现灌胃喂养冬虫夏草固体发酵物水提液的小鼠，负重游泳时间显著延长[20]。

4 冬虫夏草发酵产物的质量评价
王尊生等对冬虫夏草菌丝体固体发酵粉进行成分分析，发现发酵粉中3’-脱氧腺苷、甘露醇的含量明显高于冬虫夏草子实体中相应成分的含量；各种氨基酸的含量和水平，与冬虫夏草子实体中相应的氨基酸的含量和水平相当；发酵粉中的其他化学成分和冬虫夏草子实体中相应成分基本一致[21]。丁婷等发现冬虫夏草无性型菌株发酵液中核苷类成分分别为腺苷、尿苷、鸟苷，其含量均高于对照品冬虫夏草生药[22]。王英超等对冬虫夏草菌液体发酵过程中的酶活性进行测定，发现淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶的活力均随反应时间的延长而逐渐增加[23]。Li 等研究表明，现在对冬虫夏草及制品的检测指标主要有核苷、麦角甾醇、甘露醇和多糖等化合物，而另一种方法则是通过比对相应组分的化学图谱来对冬虫夏草进行质控，如CE （毛细管电泳） 等，相对于对单个化合物的鉴定，这种方法更为方便可行[24]。

5 小结与讨论
综上所述，目前对冬虫夏草发酵的研究主要包括菌株的筛选、液体发酵工艺的摸索、固体发酵技术的开发和发酵产物的评价及应用几个方面，其中确定研究菌株是否是真正的冬虫夏草无性型（中国被毛孢） 成为其中最关键的问题之一。近年来，有许多关于冬虫夏草发酵研究的报道，但当中有很多的研究结果不太一致，如培养温度的选择，范围从18℃～30℃都有报道，如吴彩琴等的研究[25]；培养时间的长短，范围从48 h～40 d 也有报道，但冬虫夏草是一种生长缓慢，且生长温度相对较低的真菌，所以温度和生长周期应该是其重要的研究考虑因素[15， 26]，而很多研究都忽略了这一点，也缺乏对研究菌株的鉴定，因此，相关研究的菌株可靠性还需要进一步证实。出现上述情况可能有以下几个原因：第一，可能研究菌株并非真正的冬虫夏草；第二，可能该冬虫夏草菌株经过改良，已经可以适应相对较高的温度；第三，该实验可能只在该次实验条件下成立。对此，仅对有可靠菌种来源或从培养温度和时间上符合冬虫夏草生长规律的发酵研究进行综述。
鉴于冬虫夏草对生长环境和培养条件的苛刻要求，分离出真正的菌种是非常关键的，而目前人们对冬虫夏草的研究主要是集中于其药理活性的开发，各种与冬虫夏草相关的制品在保健品市场随处可见，如百令胶囊、金水宝胶囊、宁心宝胶囊、至灵胶囊和心肝宝胶囊等。但研究发现，当中某些产品的确是用冬虫夏草的无性型来生产的，但也有一些是来源于天然冬虫夏草菌菌体上分离到的其它菌类，并非真正的冬虫夏草菌[27]。当然并不否认，从冬虫夏草菌体上分离到的某些非冬虫夏草无性型的其它真菌也会有很好的保健或药用功效，如蝙蝠蛾拟青霉。但从科学的角度来看，这些研究与真正的冬虫夏草菌种关系不甚密切。所以，进行对冬虫夏草的研究之前，对研究菌株进行鉴定是很有必要的。分子生物学方法是鉴定冬虫夏草无性型的有效方法之一[9]，只要能以科学的态度去对待研究及生产上所采用的“冬虫夏草”菌种问题，通过分子生物学等技术手段，则可对冬虫夏草的发酵研究有更深入的认识。