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草菇菌种液体培养及出菇试验研究
李崇 李森柱 谢意珍 罗彪 吴清平*
（广东省微生物研究所，广东广州510070）
自1964年由广东省微生物研究所科研人员首次将纯培养草菇（Volvariella volvacea）菌种应用于生产中并获得成功以来，人们不断努力，在菌种选育、制种、接种和栽培方式等方面，进行了大量研究和改进。但四十多年来，草菇制种仍处于小作坊固体制种方式，严重制约了草菇的工厂化和规模化生产进程。由于液体菌种具有菌丝生长迅速、菌龄整齐、接种点多、萌发快、周期短等优点[1]。早在1948 年美国的H.Humfeld 等就对蘑菇进行了深层发酵研究，国内较早的报道是1960年上海植物生理研究所的陈美聿等人进行的香菇深层发酵研究。由于食用菌在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长，能在短期内就能获得大量的菌丝体或菌种[2]-[4]。20 世纪80 年代后，国内外纷纷开展了这一技术的研究与应用探讨。
目前液体深层发酵技术除了广泛应用于食用菌多糖和其他组分的提取外，液体培养制种技术在香菇、平菇、金针菇等食用菌中同样已成功应用[2]，[5]，[6]。但草菇液体培养方面报道较少，目前只局限于试验室对培养条件研究和菌丝有效成分分析[7]-[11]。由于草菇是少数高温食用菌品种之一，生长快，常规的固体制种工艺为一个点位接种，造成菌种菌龄不整齐，种性不稳定，容易退化。因此，进行草菇菌种液体培养和出菇试验研究，对改变草菇传统制种方式，探索草菇工厂化和规模化生产途径具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 供试草菇菌株粤草-01，来自广东省微生物研究所食用菌研究发展中心。
1.2 培养基配方
1.2.1 斜面培养基马铃薯200 g（煮沸20 min 滤取滤液），蔗糖20 g，琼脂20 g，自然pH。
1.2.2 液体培养基麸皮粉、高粱粉、黄豆粉、稻草、马铃薯、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、琼脂、KH2PO4、MgSO4、CaCO3。先将麸皮粉、马铃薯、黄豆粉、高粱粉和稻草分别煮水，用纱布过滤
弃渣，与其他组分按表1配方进行配制。
1.2.3 固体过渡种培养基和制作95％木屑或谷壳，2％蔗糖，3％ CaCO3，稻草水（稻草煮水过滤弃渣）适量混匀，用500 mL三角瓶分装，在0.1 MPa，121℃条件下，保压30 min灭菌，待冷却后，接入10％二级液体种，置于30℃条件下培养2 d，备用。
1.2.4 栽培出菇培养料制作80％废棉花，15％碎稻草，5％CaCO3，将这些培养料用水泡湿，搅拌均匀，用薄膜盖住堆沤48 h，湿度以成年人手抓握料不滴水为宜（含水量约60％）备用。
1.3 液体培养液体培养基按表1 配方进行配制，分别分装成100 mL／500 mL三角瓶（一级种）和200 mL／500 mL三角瓶（二级种），于0.1 MPa，121℃条件下，保压30 min灭菌，待冷却后备用。首先接入菌种，置于摇床0~18 h，90 r/min，18 h以后120 r/min，30℃条件下进行一级培养。然后以5％的接种量接入一级种，进行二级培养筛选培养基，摇床转速：开始培养90 r/min，18 h后调为120 r/min，在30℃（±1℃）条件下培养60 h。
1.4 生长曲线测定
以上述筛选较佳的配方进行草菇摇瓶液体培养，从12~24 h期间，每隔6 h取样测定一次，24 h后每隔12 h取样测定一次，主要测定菌丝量和pH 值。其中菌丝量的测定方法为：取10 mL 培养液，在3 500 r/min 离心10 min，弃上清液，然后烘干称重，再将这些数值减去接种后培养前0时样的重量，即为增长的菌丝量。当菌丝量出现下降时，终止试验，并绘制生长曲线。
1.5 栽培出菇方法
将堆沤好的栽培料分别按10％的接种量接入木屑过渡种、谷壳过渡种和液体二级种，控制培养温度31℃，培养湿度85％，待菌丝长满后喷出菇水。
2 试验结果
2.1 液体培养基筛选
以二级种（按表1配方配制）培养观察菌丝生长情况，配方Ⅰ菌丝量少，培养液比较浑浊，与培养初期的外观相似，没有受到污染，说明培养基利用差；配方Ⅱ菌丝球多，大小均匀，直径在1~2 mm；配方Ⅲ和配方Ⅳ菌丝球多，直径在2~4 mm大小不均；配方Ⅱ~Ⅳ，菌丝球均匀分散在培养液中，培养液清亮透明，培养基利用较好；配方Ⅴ菌丝球基本长满，大小不均，培养液为胶体状，开始出现溶菌，说明培养条件不能满足，提取出现菌丝自溶（表2）。从培养结果看，配方Ⅱ作液体种比较理想，有利于工厂化生产要求：菌株大小均匀，直径在1~2 mm，机械接种，均匀分散，不易堵塞，容易清洁。
2.2 草菇液体培养生长情况及pH 变化
根据培养基配方筛选，选择配方Ⅱ进行摇瓶液体培养试验，通过显微观察及测定草菇菌丝的生产情况和pH变化。结果表明：0~12 h，菌丝生长不明显；18 h检查菌丝开始生长，在18 h之前pH基本无变化；24 h观察，菌丝成絮状，量较少，；36 h观察，菌丝量大幅度增加，成絮状，分布均匀，培养液逐步澄清；48 h以后，菌丝成絮状，分布均匀，量多，菌丝长满整个培养液，培养液澄清；72 h 菌丝量开始下降；整个培养过程pH 变化呈缓慢上升趋势。表3和图1所示，选择培养48 h左右的菌龄作为菌种比较理想，因为此时正处于生长对数中后期，菌丝量大，活力强。
2.3 草菇液体菌种出菇试验
采用木屑过渡种，第2 天培养料表面菌丝长满，菌丝生长均匀，但不够浓白，生长速度较快；采用谷壳过渡种，培养到第3天，菌丝长满料面，菌丝浓密纯白粗壮，但不够均匀；这两种方法形成的子实体椭圆或卵圆形，个体大，黑白分明。采用液体二级种，培养到第2天，菌丝长满料面，菌丝生长稀疏，不够浓白，且生长速度不快，形成的子实体椭圆或卵圆形，个体小，黑白分明。从表4的出菇试验结果以及图2的出菇效果图看出，采用木屑过渡种，可以达到常规栽培的效果。
3 讨论
试验表明，按照常规方法直接将液体种喷洒接种到固体栽培料上，需要适应期，同时水分不易掌握，因此出菇效果并不理想；而利用分散度较好的材料（如木屑）制作固体过渡种，接种到栽培料上不需要适应期，菌种以易分散的固体（小颗粒等）形式，接种操作方便，达到多点接种、萌发点多的效果，大大减少了栽培生产中污染的机会，达到了较好的出菇效果。
液体培养制种从一级种、二级种培养到固体过渡种，共需6~8 d 的时间，相当于常规固体种的三级种培养时间。因此采用本研究建立的制种技术，只需常规制种时间的1/3~1/2，有效地缩短了制种周期，经出菇试验，可以达到常规种的效果。
经试验液体培养菌种具有：①菌种在反应器内可人为控制生长条件，菌丝生长分裂迅速，菌龄整齐，培养周期短；②当接入固体培养料，接种点多，萌发快，可减少污染；③萌发点多、缩短出菇周期等优点。因此，采用草菇液体深层培养制种方式，进行工业化生产是可行的，能提高自动化程度，降低劳动强度，较好地解决传统的草菇制种方式存在的问题，对保证菌种的稳定性和草菇产品的质量，具有较好的现实意义。
