admin
不同载体包埋食用菌菌种的实验研究*
李凤美1，周永斌2，訾惠君2，刘连强2
（天津市林业果树研究所，天津300384）
食用菌菌种的包埋是指采用物理方法，将食用菌菌丝体包裹在凝胶的网格结构中或半透性聚合薄膜内，使其保持活性并可反复使用的一种技术。包埋法操作简单，条件温和，包埋后的微环境相对封闭，是目前固定化技术中最有效和实用的一类方法。被包埋的菌种常常用于液体发酵上，生产初级或次级代谢产物，有关研究显示食用菌菌丝体包埋后，相比游离细胞不仅延长了菌种的应用时间，且发酵得到的目标产物均有小幅提高[1-3]。包埋载体的选择是包埋技术中十分关键的一步，所选择的载体应无毒，不影响细胞代谢，有一定的保水性，成本低，有较高的细胞负载量和活性[4]。本实验选取不同的载体材料对食用菌菌种进行固定化包埋，通过比较载体的机械强度、操作难易、有无毒害、菌株复水活化情况等选出适合的载体，并对包埋剂的浓度、成分配比等进行试验研究，从而确定最适的包埋条件。
1 实验材料
1.1 菌种
所用菌种为本实验室自有的平菇、灵芝、杏鲍菇菌种。
1.2 培养基
PDA 综合培养基：马铃薯去皮200 g （加水煮沸20min，过滤取汁）、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g，水1 000 mL，pH 值5.8~6.2。分装，0.1 MPa 灭菌20 min。
1.3 实验试剂
海藻酸钠（SA）、聚乙烯醇（PVA）、卡拉胶、明胶、丙烯酰胺单体、N，N’－亚甲基双丙烯酰胺（BIS）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸钾（K2S2O8 ） 、二醋酸纤维素、2%氯化钙溶液（121℃灭菌30 min）、4%硼酸溶液（121℃灭菌30 min）、丙酮，以上化学试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 菌丝体细胞悬浮液的制备方法
制备PDA 液体培养基，分装后121℃灭菌30 min，冷却。各取一小块食用菌母种接种于液体培养基上，25℃摇床上培养15 d，将得到的菌丝体小球用无菌水冲洗、过滤、碾磨，加少量的无菌水制成悬浮液。
2.2 菌种包埋方法
2.2.1 海藻酸钠（SA） 包埋
加热制备3%的海藻酸钠溶液，冷却到40℃后加入少量菌体细胞悬浮液，用针管滴入到2%的氯化钙溶液中，静置3 h～4 h 完全硬化，用无菌水洗净制得海藻酸钠包埋小珠。
2.2.2 明胶包埋
加热制备质量浓度为10%的明胶溶液，冷却到40℃后加入少量菌体细胞悬浮液混匀，倒培养皿中铺平板，待其冷却凝固后切成边长4 mm～5 mm 的方块。
2.2.3 卡拉胶包埋
加热制备质量浓度为2%的卡拉胶溶液，冷却到40℃后加入少量菌体细胞悬浮液混匀，倒入培养皿中铺平板，待其冷却凝固后切成边长4 mm～5 mm 的方块。
2.2.4 醋酸纤维素包埋
2.2.4 醋酸纤维素包埋
取1 g 二醋酸纤维素加到15 mL 丙酮中，搅拌使之溶解，加入少量菌体细胞悬浮液混匀，用针管滴入无菌水中，形成珠体。
2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶包埋
将少量丙烯酰胺单体和N，N’－亚甲基双丙烯酰胺（BIS） 溶于水；将菌体细胞悬浮液加入上述混合液中，搅拌均匀；在上述溶液中，加入四甲基乙二胺（TEMED） 和过硫酸钾（K2S2O8），室温下放置30 min，使之聚合完全，得到聚丙烯酰胺凝胶；将上述凝胶切成边长4 mm～5 mm的方块，用生理盐水洗净，备用。
2.2.6 聚乙烯醇（PVA） 包埋
将PVA 加热溶于水，制备质量浓度为10%的PVA 溶液，冷却至40℃后加入少量菌体细胞悬浮液混匀，用针管滴入到4%的硼酸溶液中，静置12 h 硬化，取出后用无菌水冲洗备用。
2.3 包埋载体的强度测试
两块载玻片之间放置粒径相近的包埋小球，在上面的载玻片上加100 g 砝码，观察小球外形有无变化，看是否有裂痕，是否被压碎来表征小球的机械强度。
2.4 包埋菌株的复水活化试验
2.4 包埋菌株的复水活化试验
将包埋菌种接种到PDA 斜面培养基上，25℃恒温培养7 d～10 d，对比观察不同材料包埋菌种的成活情况及菌丝萌发情况。
2.5 包埋载体的优化实验
将聚乙烯醇加热溶于水，制备质量浓度分别为8%、9%、10%的溶液，向上述溶液中分别加入不等量的海藻酸钠，使得海藻酸钠的质量浓度分别为0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%，搅拌均匀，待混合溶液冷却至40℃后加少量菌体细胞悬浮液，将混合液用针管滴入到硬化剂中，硬化剂为2%氯化钙与4%硼酸的混合液，静置10 h，取出，用无菌水冲洗备用。
3 实验结果及分析
3.1 各种载体材料制备包埋菌种的难易情况及表观特征
不同载体制备包埋菌种的难易情况以及表观特征见表1。
由表1 可知，采用海藻酸钠、明胶、卡拉胶作载体包埋菌种，复水活化后，菌株成活率都在85%以上。但明胶和卡拉胶的机械强度较低，颗粒极易破碎使得被包埋细胞泄出，并且明胶切块时易粘连，不容易操作，卡拉胶虽然不粘连但机械强度太低，因此这2 种材料都不适合作菌株包埋的载体。采用醋酸纤维素和聚丙烯酰胺作载体，虽然包埋颗粒的机械强度高，化学性能稳定，但是菌株复水活化后成活率太低，其原因可能是醋酸纤维素中添加的丙酮对菌株细胞有毒害，而丙烯酰胺单体在形成聚合物网络时，形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大。因此这两种材料也都不适合作菌株包埋的载体。采用海藻酸钠作载体，成球容易，小球形状较为规则，制备操作较为容易，菌株复水后成活率较高，缺点是海藻酸钠机械强度不高。由于海藻酸钠无毒，其溶胶、凝胶过程比较温和，且生物相容性良好，因此常用于作包埋药物、细胞、蛋白的微胶囊载体。采用聚乙烯醇作载体，其机械强度很高，用100 g 砝码挤压被包埋小球，小球外形基本无变化，且对微生物无毒，菌株复水后成活率达80%。存在的问题是聚乙烯醇质量浓度低时无法凝集成球，浓度高时虽能成球，但极易粘连，被包埋小球拖尾现象严重。聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体，它具有机械强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列优点，近年来在国内外获得了较广泛的研究[5， 6]。
综上可知海藻酸钠和聚乙烯醇两种材料适于做菌种包埋的载体，且两种材料的优势互补，因此可将二者以一定比例混合，进行优化配比，来提高包埋菌种的机械强度，防止粘连，使操作变得容易。
3.2 包埋载体的优化实验结果
3.2 包埋载体的优化实验结果
PVA-SA 混合法制备包埋菌种的操作情况见表2。
从表2 中可知，以聚乙烯醇PVA 为包埋剂，添加适量的海藻酸钠SA，可防止粘连现象发生，利于载体成球。海藻酸钠的添加量在0.8%最好，不仅促进成球且无粘连。随着海藻酸钠含量的增加，过多的海藻酸钠反而会使载体溶剂黏度增大，粘连现象加剧，固化操作困难，因此选择海藻酸钠SA 添加量为0.8%，聚乙烯醇PVA 的浓度在10%时，成球较易，球形状规则，无粘连，易操作。实验还发现由于海藻酸钠与聚乙烯醇二者均为亲水性的聚合物，互溶性好，混合制得的材料弹性和柔韧性明显优于单体。同时，海藻酸钠作为一种多糖类天然高分子化合物，对微生物细胞起一定的保护作用，它的引入减轻了硼酸对微生物细胞的毒性作用，提高了固定化细胞的相对活性。
综上选择10%聚乙烯醇并添加0.8%海藻酸钠作为包埋载体，进行食用菌菌种包埋，硬化剂为2%氯化钙与4%硼酸的混合液。
4 结论
用海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶、明胶、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺作载体，分别对食用菌（以平菇、灵芝、杏鲍菇为代表） 菌种进行包埋实验。通过对载体机械强度、操作难易情况、固定化细胞活性进行对比发现，海藻酸钠和聚乙烯醇两种材料适合作包埋载体，由于二者优势互补，因此将两种材料混合进行优化配比实验，最终确定以10%聚乙烯醇添加0.8%海藻酸钠为包埋剂，对菌株进行包埋，而后滴入2%氯化钙与4%硼酸的混合液进行硬化，可制得固定化菌种。
